جداسازی ایزوله هایی از اکتینومیست های مولد آنزیم کیتیناز و کلونینگ ژن کیتیناز آنها در باکتری

کیتین، پلیمر پلی ساکاریدی بدون شاخه با اتصالات β(1 4 از واحد¬های n- استیل گلوکز آمین است. این ماده فراوانترین آمینوپلی ساکارید و بعد از سلولز دومین بیوپلیمر فراوان در طبیعت است. این ماده ترکیب اصلی دیواره سلولی اکثرقارچ¬ها، کوتیکول حشرات، پوشش خارجی نماتد¬ها و تخم و کیست آنها را تشکیل می¬‏دهد ولی در گیاهان عالی و مهره‏داران یافت نمی¬‏شود. لذا یکی از استراتژی¬‏های کاربردی در مبارزه بیولوژیک با بیماری¬های گیاهان، هدف قراردادن کیتین در پاتوژن¬ها می¬‏باشد. به این ترتیب، آنزیم کیتیناز به عنوان آفت کش محسوب شده و کیتیناز یکی از ترکیبات کنترل بیولوژیک قلمداد می‏شود. بر این اساس با هدف به دست آوردن یک آنتاگونیست مولد کیتیناز از خاک¬های زراعی مناطق سیرچ و ماهان استان کرمان، تعداد 110 جدایه اکتینومیست غربالگری شد. پس از آن، جدایه¬های اکتینومیست به دست آمده از نظر فعالیت کیتینازی ارزیابی گردیدند و از 110 جدایه موجود، تعداد 32 جدایه با فعالیت کیتینازی جداسازی شد که از بین آنها 18 جدایه فعالیت کیتینازی بیشتری از خود نشان دادند. سپس به منظور غربالگری جدایه¬های اکتینومیست دارای فعالیت کیتینازی در تولید ماده ضد قارچی، آزمون زیستی علیه تعدادی قارچ بیماریزای خاکزی انجام شدکه از میان آنها، جدایه¬های 400، 401، 403، 410، 420، 422 و 423 دارای بیشترین فعالیت آنتاگونیستی بودند. سپس برخی خصوصیات مورفولوژیکی، بیولوژیکی و بیوشیمیایی این جدایه¬ها در شرایط آزمایشگاهی ارزیابی شد. با انجام مطالعات گلخانه¬ای مشخص شد که این جدایه¬ها در شرایط گلخانه¬ای نیز قادر به کنترل قارچ¬های مورد بررسی هستند. در ادامه به منظور جداسازی ژن کد کننده ی کیتیناز، استخراج rna کل از این جدایه¬ها صورت گرفت و پس از ساخت cdna و تکثیر قطعات توسط آغازگر¬های اختصاصی، نمونه¬ها در وکتور ptz57r/t کلون و سپس تعیین توالی شدند. مقایسه توالی اسید آمینه¬ای ژن¬های کیتیناز جداسازی شده با استفاده از نرم افزار dnaman نشان داد که هیچ یک از ژن¬های کیتیناز جدایه¬های مورد بررسی با هم کاملا" مشابه نیستند. درخت فیلوژنتیکی رسم شده با استفاده از ترادف نوکلئوتیدی ژن¬های کیتیناز جداسازی شده نشان داد که دو ژن متعلق به جدایه 400 در یک گروه، ژن¬های جدایه¬های 403، 410 و 423 در یک گروه و ژن¬های جدایه¬های 422 و 423 در گروهی دیگر قرار می¬گیرند و ژن کیتیناز جداسازی شده از s. plicatus در یک زیر گروه جداگانه قرار می¬گیرد. به طور کلی ژن¬های کیتیناز بدست آمده از جدایه¬های دارای فعالیت کیتینازی در این تحقیق، تشابه زیادی با کیتینازهای خانواده 19 گلیکوزیل هیدرولازها داشتند. تحقیقات نشان داده که کیتینازهای متعلق به این خانواده، نقش اصلی را در ممانعت از رشد پاتوژن¬های گیاهی دارند. لذا با توجه به قدرت تجزیه کنندگی قوی کیتین و اثبات اثرات آنتاگونیستی جدایه¬های استرپتومایسسی بررسی شده در این تحقیق در شرایط آزمایشگاهی و گلخانه¬ای، باید آنها به را به عنوان یک عامل مؤثر در کنترل بیولوژیک، مورد مطالعه فراتر مزرعه ای قرارداد. همچنین با تشدید بیان ژن همسانه¬سازی شده، می¬توان از آن به طور مستقیم به عنوان یک عامل بیوکنترل موثر علیه پاتوژن¬های کیتین دار استفاده کرد. از سوی دیگر، امکان استفاده از جدایه¬های دارای فعالیت کیتینازی و یا ژن همسانه¬سازی شده از آنها در مدیریت ضایعات کیتینی که یکی از مسائل مهم امروزی است، نیز وجود دارد.